为了获得单一且高纯度的灵芝菌株,需要通过生物手段从混合微生物群落中分离出灵芝。
灵芝菌种孢子分离法
一种从灵芝子实体中收集成熟的有性担孢子,培养并萌发成纯菌丝的方法。孢子分离出的菌丝菌龄短,活力强,有性孢子具有亲本的遗传特性,是选育新菌株和杂交育种的材料。
1.孢子采集:以灵芝为例,选取红褐色·有光泽·成熟·无白色生长环的典型个体,见瓶(袋)上有少量散在的孢子粉,切去梗,用棉球蘸0.1%氯化汞溶液,反复擦拭盖的正反面,再用无菌水充分清洁破洞。孢子采集方法如下。
(1)弹射法:在无菌条件下,用烧过的粗注射针在灵芝切断柄的地方钻一个深入菇肉的小孔,插入培养皿的铁丝架中。培养皿置于铺有纱布的搪瓷盆中,盖上钟罩或无底蘑菇瓶,在28-30·相对湿度90%的条件下培养。当大量褐色孢子落入培养皿时,取下钟罩和支架,盖上培养皿,用透明胶带或无菌纸密封备用。所有使用的器械必须事先用纸包好,进行灭菌和无菌操作。
(2)贴壁法:在锥形瓶(即三角瓶)中装入1 cm厚的PDA培养基,用棉塞灭菌,冷却至平板状。无菌条件下,如上所述对无柄子实体表面进行消毒,放在无菌纸上,沿菌管方向切开几个小块,然后拔出锥形瓶塞,将小块子实体的皮壳部分蘸上胶水粘在棉塞底部,放回锥形瓶口上。28~30培养时,棕色孢子落在培养基表面,无菌条件下可去除棉塞上的菌块。
附着方法也可以附着到试管斜面正上方的管壁上。如果菇盖比较厚,可以切掉一部分皮和肉。当孢子散落在斜面上时,取出蘑菇块。
2.菌丝体培养:在无菌条件下,将弹射法收集的少量孢子浸入接种环中,在斜面上摇匀,或将少量孢子放入试管中的无菌水中(最好用20%灵芝子实体煮汁)制成孢子悬液,然后浸入斜面或平板上,在28~30培养。用附着法在平面或斜面上接收的孢子,可直接在适宜的温度下培养一周左右。孢子萌发后,挑取萌发早·生长旺盛的菌落,移植到新的斜面上,培养后得到母种。
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