农药分析薄层色谱法的原理

　　薄层色谱是从柱色谱和纸色谱发展而来，兼有两者的特点，和柱色谱一样，属于开放式色谱。1938年伊马洛夫（N.A.Izmailov）等首先用氧化铝、氧化镁在薄层板上分离植物成分，1949年马哈德（J.E.Meinhard）等首先添加粘合剂研制性能稳定的薄层，1954年柯奇纳（J.G.Kirchner）等将薄层色谱用于农药残留分析，直到1957年斯塔尔（E.Stahl）改进了仪器设备、吸附剂规格和操作方法，薄层色谱法才有了较快的发展；60年代始用于农药产品分析中杂质的分离。

　　薄层色谱法原理

　　吸附色谱法是以玻璃板上的吸附剂薄层为固定相，薄层缸中的展开剂为流动相。薄层板上农药各组分的理化性质不同，受吸附剂的吸附作用和展开剂的洗脱作用（溶解）不同，各组分随展开剂由原点向预定的前沿移动时，在两相间反复进行吸附和解吸附，吸附强的成分移动速度慢，迁移距离小；吸附弱的成分移动速度快，迁移距离大，从而达到分离纯化的目的。根据各组分最终显出的谱带或斑点，即可进行定性和定量分析。

　　薄层色谱法制板技术

　　制备薄层板需经吸附剂的选用、涂铺吸附剂和活化三步：

　　1、选用吸附剂:主要有硅胶和氧化铝二类吸附剂。硅胶的吸附性是由其表面-OH基与极性化合物形成氢键所致，可用于各类农药的分离和测定。氧化铝的吸附机理不清，适于中性和碱性物质的分离，常用于含氮农药的分离。商品制剂有：①不加粘合剂的硅胶（或氧化铝）H；②加入10～15%烧石膏的硅胶（或氧化铝）G；③加有荧光指示剂的硅胶（或氧化铝）GF：有GF254、GF365或GF254+360等。根据需要选用。硅胶G用得最多，进行荧光显色时，需使用带有荧光的吸附剂。

　　2、涂铺吸附剂:吸附剂应均匀地铺在玻璃板上，使薄层的厚度一致，则展开后同一化合物的移动距离才能保持恒定。铺层方法有湿法和干法两种：①湿法。加水把吸附剂调成糊状，用涂铺法或倾倒法铺层。涂铺法需用涂铺器，其上有装糊状吸附剂的槽和调整厚度的装置；倾倒法是把糊状吸附剂直接倒在玻璃板上，轻轻摇动敲打，使吸附剂均匀分布。湿法制的薄层比较牢固，可采用较细的吸附剂（直径约50～75微米），在农药产品分析或用作制备色谱时，薄层的厚度为0.5～1毫米，农药残留分析时，为0.25毫米。目前已有各种规格的预制薄层板出售。②干法。用两端带有套圈的玻璃棒，把干吸附剂均匀地铺在板上，吸附剂颗粒的直径为75～150微米，薄层厚度大于湿法制的板，试样负载量大，但吸附剂固着性差，分离能力和重复性不如湿法，较少使用。

　　3、活化:涂好的薄层板自然风干后，要进行活化处理，即在一定温度下，除去薄层上所吸附的水分，提高其对样品的吸附能力，吸附剂的含水量与吸附性能有关。不含水分则活性最大，但吸附力过大，组分移动慢，分离效果差。反之，吸附作用很弱，移动太快，分离效果亦不好；硅胶板在105～120℃活化（烘干）半小时，含水量5～15℃，氧化铝板在80～100℃活化半小时，含水量为3～6%，最适合测定要求。

　　分析方法

　　可进行定性分析和定量分析，方法步骤如下：

　　1、点样：使用微量注射器、定量毛细管或刻度移液管，将样品溶液点加在薄层板上的步骤。农药产品分析或制备纯品时，将含有效成分20～40毫克约0.1～1毫升的溶液点成一条直线，主要用于分离杂质。微量分析时，取约5～10微升的溶液点成圆点，将农药标样系列与待测样品点在同一薄层板上，用于直接定性定量测定。

　　2、展开：将点好药样的薄层板底端放入层析缸中，缸内预先放入展开剂，使其蒸气达饱和状态，展开剂带动样点沿一定方向移动，溶剂前沿达到离点样处约10～15厘米即可。展开剂的选择是使农药和杂质分离的关键，被测农药、吸附剂的活性级别和展开剂的极性应正确配合，极性弱的农药不易被薄层吸附，应采用活性大的吸附剂和非极性展开剂；而对极性农药则反之，使用活性小的吸附剂和极性稍大的展开剂。常使用两种溶剂作展开剂，以非极性和弱极性溶剂为主，加入较强极性的溶剂以调节其极性。对于难分离的物质，可多次重复展开，也可改换溶剂后展开或变换90°角进行双向展开，展开后将板取出风干。

　　3、显色：为了确定农药组分谱带或斑点的位置，须进行显色。方法有：①荧光显色。以荧光吸附剂制板，展开后在紫外灯照射下，具有芳香环、杂环或共轭双键的农药，在紫外光区有吸收，在白色背景上形成紫色谱带，可以使用此法；②直接喷洒氯化钯溶液。含硫农药呈现黄色；③喷洒硝酸银一氢氧化铵溶液。在紫外灯或日光照射下，含卤素的农药显棕黑色；④将薄层板放入有碘的容器中，多数农药在碘蒸气中呈黄色。⑤薄层酶抑制显色法。

　　4、定性分析：根据显色后谱带或斑点的位置，计算各组分的比移值（Rf）。

　　式中原点即点加药样的位置，展开剂前沿是指展开剂移动的终止位置。同一农药在相冏条件下的比移值是不变的，可以作为定性的指标。

　　5、定量分析常用的方法有：①溶出定量法。将农药谱带或斑点从板上刮下，用溶剂提取后，可采用化学法、极谱法、可见—紫外分光光度法、红外光谱法等测定，常用于农药产品分析；②色阶比色法。显色后用目测法比较标样系列与待测样品的面积大小或颜色深浅，可达到半定量目的；③可用薄层扫描仪或薄层分光光度计对斑点进行原位定量检测，后两者用于农药微量分析。

　　薄层色谱法应用

　　薄层色谱法在农药分析上是仅次于气相色谱法和液相色谱法的分离手段，它装置简单，操作方便，常应用于以下几方面：①提纯或制备农药标准品；②在残留分析中，可对薄层板上的农药斑点直接进行原位定量，尤其适用于气相色谱条件下不稳定农药的残留分析；③农药常量分析时，由于薄层板均匀程度和点样重复性的影响，原位定量方法的精密度不能满足要求，因此薄层色谱法不直接用于定量分析，但当产品中杂质较多而干扰测定时，可使用薄层色谱法将农药和杂质分离后再用化学分析法、比色法或紫外光谱法等进行测定。近年来发展了高效薄层色谱法，吸附剂的颗粒从50～75微米下降到3～10微米，其分辨率几乎与相当，有正相板和反相板之分。正相板如上述，反相板使用极性小的C18化学键合相（见）制板，以强极性的丙酮或甲醇水溶液作展开剂，极性强的组分有较大的比移值，扩大了薄层色谱法在农药分析中的应用。