掌握林下食用菌生产的主要生产技术流程和技术要点 2．菌种制作技术 (1)菌种的分类 俗话说：“三分种（种子），七分种（种植）。”好种是保证丰产、丰收的基础。食用菌的菌种指人工培养进行扩大繁殖和用于生产的纯菌丝体。菌种质量的好坏直接影响栽培的成败和产量的高低，只有优良的菌种才能获得高产和优质的产品，因此生产优良的菌种是食用菌栽培的一个极其重要的环节。根据菌种的来源、繁殖代数及生产目的，把菌种分为母种、原种和栽培种。 母种：从孢子或组织分离培养获得的纯菌丝体。生产上用的母种实际上是再生母种，又称一级菌种。母种既可繁殖原种，又适于菌种保藏。 原种：将母种在无菌的条件下移接到粪草、木屑、棉籽壳或谷粒等固体培养基培养的菌种，又称二级菌种或瓶装菌种。原种主要用于菌种的扩大培养，有时也可以直接出菇。 栽培种：将二级菌种转接到相同或相似的培养基上进行扩大培育，用于生产的菌种，又称三级菌种或袋装菌种。栽培种一般不用于再扩大繁殖菌种。 (2)菌种生产的基本设备 ①配料室设备 不同的生产规模，配料所需要的设备有所不同，但配料应在有水、有电的室内进行，其主要设备有以下几类： 衡量器具：配料室一般应配备磅秤、手秤、粗天平、量杯、量筒等，以供称（量）取用量较大的培养料、药品和拌料用水等。 拌料机具：拌料必备的用具有铁铲、铝锅、电炉或煤炉、水桶、专用扫帚和簸箕等。具有一定规模的菌种厂，还应具备一些机械设备，如枝丫切片机、木片粉碎机、秸秆粉碎机和拌料机等。 装料机具：采用手工装料，无需特殊设备，只要备一块垫瓶（袋）底的木板和一根“丁”字形捣木（供压料时用）即可。但具有一定规模的菌种厂，为了提高装料效率，应购置装料机。装料时，以玻璃瓶作容器的要压料和打接种穴，可用瓶料专用打穴器。以塑料袋作容器，制银耳和香菇栽培种，一般装料后随即要在袋壁打接种穴，可用塑料袋专用打穴器。 ②灭菌设备 灭菌设备一般是指用于培养基和其他物品灭菌的蒸汽灭菌锅。灭菌锅是制种工序中必不可少的设备。灭菌锅消毒的原理，是利用水吸收一定的热量之后成为饱和蒸汽，在消毒灭菌时，饱和蒸汽在一定的温度和压力下拥有大量的热量，遇到冷的消毒物体时，冷凝而改变状态随之释放出大量的热量，使被消毒物体受热、受潮，在热和湿的作用下，可在较短时间内有效地将顽抗性的细菌芽孢及其他杂菌杀死，达到灭菌的目的。 A，高压蒸汽灭菌锅：高压蒸汽灭菌锅是一个密闭的、能承受压力的金属锅，在锅底或夹层中盛水，锅内的水煮沸后产生蒸汽。由于蒸汽不能向外扩散，迫使锅内的压力升高，即水的沸点也随之升高，因此可获得高于100℃的蒸汽温度，从而达到迅速彻底灭菌的目的。高压蒸汽灭菌锅有以下几种类型。 手提式高压灭菌锅：此种灭菌锅的容量较小，主要用于母种斜面培养基、无菌水等灭菌，可用煤气炉、木炭或电炉作热源，较轻便、经济。 立式和卧式高压灭菌锅（柜）：这两类高压锅（柜）的容量都比较大，每次可容纳750mL的菌种瓶几十至几百瓶，主要适用于原种和栽培种培养基的灭菌，用电热作热源。 自制简易高压锅：菌种生产量较大的菌种厂可自制简易高压锅。采用10mm厚的钢板焊接成内径为l10cmx 230cm的筒状锅体，底和盖用15m厚的钢板冲成半圆形，否则平盖灭菌时棉塞易潮湿。锅口用紧固的螺丝拧紧密封，锅上安装压力表、温度计、安全阀、放气阀、水位计、进出水管等设备。以煤作燃料，用鼓风机助燃升温。将菌种袋（瓶）放入铁提篮内，吊入锅中，一般放4-5 层，每锅装800 -1000袋（瓶），适合于专业菌种厂制作栽培种培养基的灭菌。 B．土法灭菌锅：土法灭菌锅有多种类型，一般分为土法蒸锅和蒸笼等形式。 土蒸锅：用砖砌成灶，灶上用砖和水泥砌成桶状或方形蒸汽室，底部为大铁锅。可从侧面开门，也可以从顶盖进出。门上附有放温度计的小孔，铁锅上沿设有进出水管。每锅可装1200 - 1400袋（瓶）不等。土蒸锅形式简单，制作简易，可以就地取材，造价低廉，但杀菌时间较高压锅长。 —蒸笼锅：蒸笼灭菌适宜于农村制种量小、条件差的单位。采用蒸笼灭菌时，密闭条件较差，由于锅内温度最高是100℃，所以灭菌时间从温度达100℃开始计时，需保持6-9h。 ③接种设备 接种设备是指分离和扩大转接各级菌种的专用设备，主要有接种室、接种箱、超净工作台及各种接种工具。 接种室：接种室又称无菌室，是进行菌种分离和接种的专用房间。此室的设置不宜与灭菌室和培养室距离过远，以免在搬运过程中造成杂菌污染。生产量较大的菌种厂，应充分注意各个工作问的位置安排。 接种室的面积一般5 - 6m2，高2- 3m 即可，过大或过小都难于保证无菌状态。接种室外面设缓冲间，面积约2m2。门不宜对开，最好安装移动门。接种室内的地面和墙壁要求光滑洁净，便于清洗消毒。室内和缓冲间装紫外线灯（波长265nm，功率30W）及日光灯各·一盏，、接种室具有操作方便、接种量大和接种速度快等优点，适宜于大规模生产。 接种箱：接种箱是供菌种分离、移接的专用木制箱，实际上是缩小的接种室。接种箱有多种形式和规格，医药器械部门出售的接种箱结构严密、设备完善，但价格较高。目前多数生产者采用木材和玻璃自己加工制作成一人或双人操作箱。接种箱内顶部装紫外线杀菌灯和日光灯各一盏。箱前（或箱后）的两个圆孔装上40cm’长的布袖套或橡皮手套，奴手由此伸人箱内操作。圆孔外要设有推门，不操作时随即关门。箱体玻璃、木板均要注意密封，箱的内外均用油漆涂刷。接种箱结构简单、制造容易、造价较低、移动方便、易于消毒灭菌。由于人在箱外操作，气温较高时也能维持作业，适合于专业户制作母种、原种。 超净工作台：超净工作台是一种局部层流（平行流）装置，能够在局部造成洁净的工作环境。室内的风经过滤器送入风机，由风机加压送人正压箱，再经高效过滤器除尘，洁净后通过均压层，以层流状态均匀垂直向下进入操作区（或以水平层流状态通过操作区），以保证操作区有洁净的空气环境。由于洁净的气流是匀速平行地向着一个方向流动，故任何一点灰尘或附着在灰尘上的杂菌均很难向别处扩散转移，而只能就地排除掉。因此耕种帮建议洁净气流不仅可以营造无尘环境，而且也可以营造无菌环境。使用超净工作台的好处是接种分离可靠、操作方便。 接种工具：接种工具是指分离和移接菌种的专用工具，样式很多。用于菌种分离、母种制作和转接母种的工具，因大多在试管斜面和平板培养基上操作，一般是用细小的不锈钢丝制成。用于原种和栽培种转接的工具，因培养基比较粗糙紧密，可用比较粗大的不锈钢制成。 ④培养菌种设备 培养菌种设备主要是指接种后用于培养菌丝体的设备，如恒温培养室、恒温培养箱、摇床机等。 恒温培养室：恒温培养室用于培育栽培种或培育较多的母种和原种。恒温培养室的大小视菌种的生产量而定。室内放置菌种培养架。加温可采用电加温器或安装红外线灯加温，最好在电加温的电源上安一个恒温调节器，使之能自动调节温度。 恒温培养箱：：在制作母种和少量原种时，可采用恒温培养箱，根据需要使温度保持在一定范围内进行培养。市售的恒温培养箱多为专业厂家生产的电热恒温培养箱，使用比较方便，’但价格较贵，而且购买和运输多有不便，因此可以用木板自己制造。自制恒温箱用一只大木箱做成，箱的四壁及顶、底均装双层木板，中间填充木屑隔水保温，底层装上石棉板或其他绝缘防燃材料，箱内装上红外线灯泡或普通灯泡加温，箱内壁安装自动恒温器，箱顶板中央钻孔安装套有橡皮塞的温度计以测量箱内温度。 摇瓶机（摇床）：食用菌进行深层培养或制备液体菌种时，需设置摇瓶机。摇瓶机有往复式或旋转式两种。往复式摇瓶机的摇荡频率是80 - 120次/min，振幅（往复距）为8-12cm。旋转式的摇荡频率为180 - 220次/min。旋转式的耐用，效果较好。 塑料袋：在食用菌生产中，进行熟料栽培或制作栽培种常常用到塑料袋。选择塑料袋的根据和鉴别塑料袋的一般方法为： 进行常压蒸汽灭菌，可用聚乙烯塑料袋，厚度0.05 -0. 06mm（5-6丝）为宜。其中高压聚乙烯塑料袋透明度高于低压聚乙烯塑料袋，但低压聚乙烯塑料的抗张强度是高压聚乙烯塑料的2.2倍（厚度相同时），且低压聚乙烯能耐120℃高温。食用菌生产中应首先选用低压聚乙烯塑料袋。进行高压蒸汽灭菌时，宜用聚丙烯塑料袋，厚度0. 06mm（6丝）为宜。聚丙烯能耐1500℃高温，但其冬季柔韧性差，低温时使用应小心。聚氯乙烯塑料有毒，不到 100℃就软化。熟料栽培或制种时不能使用聚氯乙烯塑料袋。 塑料袋鉴别可采用简便易行的灼烧法。取少量样品，用镊子夹住，点燃，仔细观察塑料燃烧时的易燃性、离火后的特征、火焰特征、软化拉丝现象等，即可鉴别样品种类（表1）。 表1 塑料燃烧特征 (3)培养基 培养基就是采用人工的方法按照一定比例配制各种营养物质以供给食用菌生长繁殖的基质。培养基必须具备3个条件：一是含有该菌生长发育所需的营养物质；二是具有一定的生长环境；三是必须经过严格的灭菌，保持无菌状态。 常见的母种培养基： 马铃薯葡萄糖培养基（PDA培养基）：马铃薯200g,葡萄糖20g、琼脂18 - 20g、水1000mL。 马铃薯综合培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g、磷酸二氢钾3g、硫酸镁 1.5g、琼脂18 - 20g、维生素B110mg、水1000mL。 (4)菌种生产的流程 食用菌菌种的接种与培养是指在严格的无菌条件下大量培养繁殖菌种的过程。一般食用菌制种都需要经过母种、原种和栽培种3个培养步骤（表2）。 表2 菌种生产的流程 3．杂菌污染 (1)杂 茵 污染的原因 在制备原种及栽培种的过程中很容易感染杂菌，根据杂菌开始发生的部位，大致有以下几种污染原因： ①如果杂菌同时在培养基的上、中、下部发生，主要是由于培养基灭菌不彻底造成的。 ②如果杂菌开始发生在接种块上，很可能是母种或原种已经感染了杂菌，或者是由于接种工具灭菌不彻底，把杂菌带人接种瓶内所造成。 ③如果杂菌先在培养基表面发生，是由于接种过程中无菌操作不严格而引起的。 ④如果杂菌是在接种后若干天才发生的，并首先发生在从瓶口往下生长的菌丝上，说明杂菌是从棉塞侵入培养基的。引起原因是培养室湿度过大，通风换气不良，棉塞受潮。 (2)杂菌污染的预防措施 防止菌种被杂菌污染，应当采取综合措施，并贯穿在整个操作过程中，环环扣紧，一抓到底。具体措施如下： ①搞好环境卫生 制种人员必须建立起正常的清洁卫生制度，不断清除污物，并加以药剂消毒，不让杂菌有滋生的余地。 ②处理好原料 应严加管理，杜绝任意堆放原料，不加保护使上下受潮霉变、中间生虫、肮脏不堪的现象；木屑、草料、马粪等堆藏时，上、下要垫薄膜或油毛毡防潮，料面要遮盖，以防雨淋和杂物落人；米糠、麸皮、饼料易生霉菌，应密封贮藏。 ③调整用水量和酸碱度 培养基的水分适当，酸碱度适宜，则发菌顺利，不易生杂菌。常见的问题是：用水不称量，酸碱度不测更无调节。应该经常检测含水量，随时调整pH。 ④保护培养基 灭菌后的培养基应该加以保护。常出现的问题是：以为灭过菌，马虎了事，不遮不盖，污染严重。应该将出锅的培养瓶（袋）料加盖纱布或薄膜，人箱熏蒸前还要用新洁尔灭或来苏儿等药水擦洗，防止灰尘污染。 ⑤严格执行无菌操作规程 接种工作技术性强，一要耐心，二要细致，切忌碰擦粘带。经常出现的问题是：接种器械使用前不用酒精擦拭，使用后不清洗器械，依靠熏蒸消毒；部分人员用酒精擦拭接种器械后不使用火焰灼烧消毒。正确的做法是：对接种的一切用具及容器，能洗的要洗干净，能熏蒸的要熏蒸，能擦酒精的要擦酒精，能用酒精灯火焰烧的要用火焰烧。对大量的栽培种可以两人协作接种，把好火焰封锁关，一人持料瓶（袋），一人专接种，不离开火焰周围无菌区，配合默契，动作敏捷。    |
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