禽流感是由A型流感病毒引起鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑等家禽的传染病，同时也是一种人畜共患病、我国将其列为一类动物传染病[1]。早在1878年，该病就在意大利的流行，当时叫“鸡瘟”。1981年在美国马里兰州召开的第一届国际禽流感学术讨论会上废除了“鸡瘟”这一病名，改称高致病性禽流行性感冒。由基于该病在经济上的重要性，尤其是考虑到该病感染人的巨大威胁，对该病毒的基础研究显得迫在眉睫。目前，与其他病毒性疾病相同，禽流感的防制尚无特别有效的方法，接种疫苗是预防禽流感发生与传播的最有效手段。随着禽流感病毒多种亚型的发现，以及基础免疫学理论、分子生物学及生物技术的发展，科研人员已研发出了针对禽流感的数种疫苗。除了应用较为普遍的全病毒灭活疫苗外，对多种新型疫苗的研发也有了较大的进展。本文对目前国内外几种主要禽流感疫苗进行简要综述。
病原 禽流感病毒(AIV)属于正黏病毒科, 流感病毒属。一般多形性,直径为80-120纳米,也可见有同样直径的丝状形态,长短不一。禽流感病毒是分节段的单股负链RNA病毒,共有8个独立的RN***段,每个RN***段都以不同的核酸蛋白复合体形式存在。这8个片段编码10种蛋白,其中有8种结构蛋白, 2种非结构蛋白。病毒表面有10-12纳米的密集钉状物或纤突覆盖,病毒囊膜内有螺旋形核衣壳。两种不同形状的表面钉状物是HA(棒状三聚体)和NA(蘑菇形四聚体)。禽流感病毒粒子大约由0.8%-1.1%的RNA,70%-75%的蛋白质,20%-24%的脂质和5%-8%的碳水化合物组成。病毒蛋白包括HA蛋白、NA蛋白NP蛋白、非结构蛋白、M蛋白、聚合酶蛋白。
2 禽流感病毒的分类及致病性
2.1 禽流感病毒的分类
禽流感病毒（AIV）可按病毒粒子表面的血凝素和神经氨酸酶的糖蛋白进行分类,分为15个H亚型和9个N亚型,其血清型有H1N1、H4N2、H5N1、H5N2、H7N2、H9N2 等。其中最受关注的是含H5和H7血凝素的AIV。这些病毒常表现出具有或转变为高致病性的潜力(短期内变异),出现这种变异的原因是最初的病毒未受到强有力的控制而得以在许多鸡群中繁殖和传播。有时很难将实验室分类的结果与病毒可能在某一鸡群中引起的病情关联起来, 即无致病性AIV在有些情况下也可能表现明显的致病性。
2.2 禽流感的致病性
禽流感病毒可分为高致病性、低致病性和非致病性三大类。其中高致病性禽流感是由H5和H7亚毒株（以H5N1和H7N7为代表）引起的疾病。高致病性禽流感特点潜伏期短，传播快，发病急，发病率高，死亡率高，但传播范围往往不大。低致病性禽流感特点是潜伏期长，传播慢，病程长，发病率和死亡率低，一旦发病，如不采取积极措施，病毒很难在疫区根除，疫情会逐渐向周边地区扩散，使疫区越来越大，而且病毒毒力还有变强的可能，应高度重视。
2.3 禽流感的人致病性
在1997年香港首次发现禽流感病毒能感染人并致人死亡的事件之前,研究者虽然提出了禽流感流行的动物源性学说,即病毒在动物内形成重组后再感染人。一般认为,决定流感病毒宿主特异性的主要因素是细胞膜上的受体和HA受体的结合位点的结构。人类与禽类细胞膜上的结合位点有很大的不同,这就是为什么1株流感病毒不能同时感染人和禽的原因。常见的流感病毒受体可因其对人和禽的结合不同分为两种。但从香港分离到的 HA 受体具有两种受体结合特异性,因此易于感染人类细胞。最新的研究已经表明,人和禽的流感病毒均可感染猪。而且,禽流感病毒经过猪体中的基因重组或重排过程,可以产生能感染人的新型流感病毒毒株。
3 AIV理化性质
AIV对热敏感,加热到58℃30min,或加热到61℃10min,或煮沸(100℃)2min以上即可灭活,但病毒对低温抵抗力较强,在有甘油保护的情况下可保持活力1年以上;AIV在微生物环境中可存活1周,在水中可存活1个月,在pH=4.1时，也具有一定的存活能力。对紫外线敏感,在阳光下40-48h就会使AIV丧失活性,如果用紫外线直接照射,可迅速破坏其传染性。对消毒剂***、氯仿、丙酮等有机溶剂敏感。常用消毒剂容易将其灭活,如氧化剂、稀酸、十二烷基硫酸钠、卤素化合物( 如漂白粉、碘剂等)都能迅速破坏其传染能力。
4 禽流感的疫苗防控研究
4.1 防控研究
流感的防控主要从疫苗防疫、药物预防、饲养管理等方面综合进行防治。流感病毒水平传播效率极高, 其致病力变异极为复杂, 并且对其机制迄今知之甚少, 故禽流感的弱毒疫苗自然成为可望而不可及的奢望。传统的灭活疫苗具有良好的免疫保护性, 是禽流感防制的主动措施、关键环节和最后防线, 在许多国家禽流感防制中都起到了极其重要的作用。禽流感灭活苗的使用, 在控制疫情的同时, 也一定程度上增加了疫病监测中区分疫苗免疫与自然感染的难度,全面的综合防疫措施与基因工程疫苗相结合才是我国禽流感防制的发展方向。
4.2 国外现状
虽然国外在DNA疫苗、表达AIV血凝素蛋白的新城疫载体疫苗等新型禽流感疫苗研究方面取得了新进展，但是目前国外只有两种疫苗通过了审批并应用于防控实际，即全病毒油佐剂灭活疫苗和重组鸡痘载体禽流感疫苗。重组鸡痘载体禽流感疫苗在美国通过了审批，在欧盟没有类似的产品，但这种疫苗在美国没有使用，却广泛在墨西哥、危地马拉、萨尔瓦多等国家使用。从全球范围来看，大多数禽流感免疫预防是用禽流感油佐剂灭活疫苗。
4.3 我国现状
我国科研机构针对现行主要流行毒株亚型，研制了多种油乳剂灭活疫苗［1］和新型疫苗，取得了良好的免疫保护效果，受到联合国粮农组织、世界动物卫生组织等国际组织的关注。目前，农业部批准生产的H5亚型禽流感疫苗就有重组禽流感灭活疫苗(H5N1亚型，Re-1株)、禽流感重组鸡痘病毒载体活疫苗(H5亚型)、禽流感灭活疫苗(H5亚型，N28株)、禽流感H5-H9二价灭活疫苗、禽流感-新城疫重组二联活疫苗(rL-H5株)等5种。尽管新型疫苗展现了诱人的前景，但是与国外情形类似，目前我国仍主要使用灭活疫苗。
5 疫苗的应用及种类
由于了解流感病毒的持续遗传变异是解决流感问题的关键，所以不断地评价病毒的抗原转变对于及时捕捉到可引起人类流感大流行的毒株，并且研制有效疫苗是非常重要的。理想化的疫苗应具备以下特点：
（1）价格低廉、容易接种，对家禽具有高度的安全性；
（2）任何家禽接种都有效，免疫后既能产生体液免疫应答，又能产生细胞免疫应答，并能迅速建立免疫性保护；
（3）疫苗生产时对工作人员和环境安全；
（4）休药期短或无休药期；
但目前，还没有任何一种禽流感疫苗同时具备上述全部特性［2］。因此，逐步完善疫苗的研究显得尤为重要，现阶段常见的禽流感疫苗有以下几类：
5.1 全病毒灭活疫苗
禽流感全病毒灭活疫苗是将疫苗株病毒接种于鸡胚尿囊腔中进行增殖，经梯度离心浓缩纯化后，用甲醛或者β-丙内酯灭活处理制得。Takada 等对5周龄雌性ddY小鼠鼻腔接种用甲醛灭活的流感全病毒疫苗20μL，2～3 周后再免，最后1次免疫后1周，分别检测血清和鼻拭子样品，并同时经鼻腔攻击20倍小鼠半数致死量的病毒，结果表明，该疫苗既可产生中和抗体，又能刺激机体CTL 反应，并能抵御不同亚型流感病毒的攻击。李明义等［3-4］用禽流感病毒A/Ostrich/Denmark/77420/96（LPAI- H5N2）株及A/Chicken/ Shanghai/1/98（H9N2）株分别接种易感鸡胚，收获感染胚液并超滤浓缩，再用甲醛灭活并加油佐剂混合乳化制成油乳剂灭活疫苗，将其接种4周龄SPF鸡，结果表明，疫苗安全。
禽流感全病毒灭活疫苗具有制备工艺简单、免疫效果及安全性好、免疫持续时间长且不会出现毒力返强和变异的优点，可保护同种亚型AIV的攻击，有效避免禽流感的大暴发或大流行。但灭活苗本身存在一些缺陷，即影响疫情监测，存在散播病毒的风险，免疫剂量较大，制备成本高等。其最突出的缺点是不能诱导产生有效的黏膜免疫抗体和细胞免疫应答，因而，无法有效地抑制呼吸道中 AIV的复制［5］。
5.2 亚单位疫苗
亚单位疫苗是提取AIV具有免疫原性的抗原蛋白，加入佐剂而制成的。这种疫苗安全性好，能刺激机体产生足够的免疫力，但其抗体持续时间短，且成本高。随着重组 DNA及分子克隆技术的发展，可以将HA基因连接到载体质粒上，然后导入表达系统中，经诱导可获得大量表达的免疫原性蛋白，提取所表达的特定多肽，加入佐剂即可制成基因工程亚单位疫苗，这样可大大降低成本。刘明［6］构建了杆状病毒转移载体，分别表达了H5N1亚型禽流感病毒的HA基因和 NA 基因，用这些表达产物免疫SPF鸡，结果显示，NA＋HA 联合免疫组的免疫效果最佳。Wu 等［7］用酵母表达禽流感A/Northern shorel-er/AL/26/2006（H10N7）株的HA蛋白，然后用该蛋白免疫SPF鸡，可以产生与灭活苗相同效果的HI抗体及中和抗体。
5.3 重组活载体疫苗
利用对禽类致病性很弱的痘苗病毒或禽痘病毒作载体，构建含有免疫原性基因的重组病毒，用此重组病毒作疫苗，可在动物体内复制，并不断地表达出免疫原性蛋白，从而诱导禽类产生针对目标病原的免疫保护力，此种疫苗称为重组活载体疫苗。Boyle等［8］构建了表达H7亚型HA基因的重组痘病毒，接种2-7日龄鸡，分别于接种后第10，21天，用强毒株攻击，致死保护率分别为80%和100%。获得保护鸡有NP抗体反应，表明重组痘病毒疫苗虽可提供坚强保护，但不能完全阻止攻毒AIV的复制。Swayne 等［9］研究表明，禽流感重组痘病毒疫苗应避免用于经痘病毒疫苗免疫的鸡群或自然感染野毒痘病毒鸡群，否则，将不能诱导其对禽流感的良好免疫应答。Li等［10］将高致病性的 H7N1 血凝素基因插入到 HVT，构建了重组病毒，免疫动物产生特异性抗HVT和AIV HA 抗体，对HVT 和AIV强毒的攻击均能提供良好的保护。Qiao等［11］构建了能同时表达H5N1亚型HA基因和NA基因的重组禽痘病毒（fowl pox virus，FPV）重组疫苗，攻毒结果显示，该疫苗具有良好的免疫保护性。高宏博等［12］将AIV A/Goose/Guangdong/3/96（H5N1）的HA基因克隆于真核表达质粒中，构建了转移载体pUAB- gpt- HA，通过同源重组及霉酚酸筛选技术，将HA基因表达盒插入到HVT US10 基因区，构建了一株表达H5亚型AIV HA 基因的重组病毒 HVT（rHVT- US10- HA），经PCR、间接免疫荧光、western blot 及红细胞凝集试验鉴定，重组病毒能稳定表达具有生物学活性的HA蛋白。
重组活载体疫苗兼具死疫苗和活疫苗的优点，克服了常规活疫苗毒力返强的缺点，且免疫效果较理想。但重组载体系统本身特性以及在对插入的外源基因的选择等方面仍存在很多问题，仍需进一步研究。
5.4 核酸疫苗
核酸疫苗又称为DNA疫苗，是伴随现代分子生物学和免疫学的发展而产生的一种新型疫苗。其原理是利用重组DNA技术将保护性抗原蛋白的基因克隆到真核表达载体上，在被直接导入到动物体内后，保护性抗原蛋白基因表达的抗原蛋白经过内源性呈递给免疫系统，诱导机体产生特异性的体液免疫和细胞免疫反应。何宏轩等［13-14］将不同亚型AIV的HA基因构建了真核表达质粒，并用构建好的质粒对试验鸡进行免疫，进行攻毒后，将免疫组和对照组的试验结果进行比较，结果表明，所构建的HA基因表达质粒可作为基因疫苗诱导鸡产生免疫保护反应。张丹等［15］设计并构建了包含禽流感H5HA和H7HA1基因的双价真核表达质粒pV- H5- H7及单独表达 H5HA和H7HA1的 pV- H5 和 pV- H7HA1，通过RT- PCR，间接免疫荧光（IFA）等方法验证构建质粒的正确性和其表达蛋白的免疫原性；0，21 d 分别免疫6～8周龄的BALB/c 小鼠，设立双价疫苗组、单表达免疫组和对照组；免疫后35 d 用HPAIVH5N1进行致死性攻击，结果显示，免疫组均可刺激机体产生H5特异性抗体，pV- H5- H7 诱导产生的抗体对H5N1的攻毒保护率为80% ，而pV- H5 单表达的攻毒保护率也为80%。
核酸疫苗有许多优点，能长时间表达抗原；具有与天然抗原相同的构象和免疫原性，可同时激发机体产生细胞免疫、体液免疫和黏膜免疫应答，而且不受母源抗体的干扰；结构简单，制备方便；稳定性好，易于保存和运输；能够克服由于免疫系统发育不完善而导致的免疫力低下的缺陷；可用于制备多价疫苗或联苗。
目前，核酸疫苗还存在许多安全方面的问题：质粒DNA低水平整合到宿主基因组的潜在危险性；核酸疫苗载体携带的抗生素基因可能导致的生物学后果；产生针对双链DNA的抗体；引起免疫耐受。针对这4种潜在的危害性，美国 FDA，WHO及EU都对核酸疫苗的研制制定了一些指导性规定，为核酸疫苗的研究、生产及应用指明了方向。由于核酸疫苗成本相对较高，且不适于集约化养殖群体的免疫，因此，可考虑改进核酸疫苗生产工艺和优化疫苗接种方式来开发出价格低廉、实用化的核酸疫苗。
5.5 新型疫苗
近年来，新的分子生物学技术（如反基因操纵子技术）的应用为禽流感多价疫苗的研发提供了新的方法和途径，并由此产生了反基因工程疫苗。病毒的反向遗传技术(rever se genetics ,RG)或称病毒拯救,是指根据病毒基因组及其复制
的特点建立操作系统,利用克隆的cDNA产生病毒的过程。由于可以产生经过人工操作基因后的病毒,因此在病毒的疫苗构建方面具有良好的应用前景。
为了对抗不断改变的禽流感病毒抗原型，能够提供交叉保护性的通用疫苗逐渐成为研究者关注的热点。一些研究者还利用分子生物学手段筛选流感病毒的抗原表位，并运用计算机模拟技术对其进行优化，进而研制出抗原表位疫苗，为易变异的病毒疫苗的研制提供了新的思路［16］。此外，利用植物作为生物反应器，大量表达外源蛋白的转基因植物可食疫苗，也受到了广泛的关注。现今新型的禽流感疫苗包括冷适应流感弱毒疫苗、基因工程流感病毒活疫苗、复制缺陷型流感病毒疫苗、RNA复制子疫苗、表位疫苗、转基因植物疫苗、沙门氏菌DNA口服疫苗等。
2012年4月10日, 国际知名病毒学杂志Journal of Virology在线发表了中科院上海巴斯德研究所周保罗研究组关于高致病性禽流感H5N1疫苗的最新成果，这是世界上首次报道能诱导出针对所有高致病性禽流感H5N1亚类和亚亚类广谱中和抗体反应的免疫原。但目前，还没有任何一种禽流感疫苗同时具备上述全部特性。
在本项研究中，博士研究生周梵、研究助理王桂芹等在周保罗研究员的指导下，在全面的血清学研究基础上开发设计了能够有效地对抗所有高致病性禽流感H5N1亚类和亚亚类的免疫原的新策略。首先，她们构建了涵盖所有高致病性禽流感H5N1亚类和亚亚类代表性流行株的H5HA表达质粒库；利用该质粒库，建立了相应的假病毒库和免疫血清库；然后进行了全面的基于假病毒的血清学试验。研究人员按照试验结果，将高致病性禽流感H5N1亚类和亚亚类归纳成两大抗原群，但亚亚类2.3.2.1和7.2分别独立于这两个抗原群之外。根据上述所得抗原群，她们设计了三价疫苗，并证明其能诱导出针对所有高致病性禽流感H5N1亚类和亚亚类的广谱中和抗体反应（见图1），并对小鼠在高致死量的异源H5N1病毒攻毒下提供有效的保护。
图1 三价疫苗诱导出了针对所有高致病性禽流感H5N1亚类和亚亚类的假病毒库的广谱中和抗体反应
6 禽流感疫苗的发展方向
目前而言,研制出高效、安全、生产工艺简单、价格低廉、实用的禽流感疫苗有重要意义,对禽流感的防制越来越重要。灭活疫苗和活疫苗由于自身的缺陷,只能用于禽流感暴发时的应急免疫,以减少经济损失,而不宜作常规免疫。以哺乳动物细胞为基质制备流感疫苗,研究不深入,工艺复杂,成本较高,目前不是禽流感理想疫苗的选择。对于DNA核酸疫苗来说,免疫原单一,能长时间表达抗原,可避免母源抗体的干扰,易于构建和制备,易冻干,成本低,稳定性好,贮存和运输相对方便,成本较低廉。虽然核酸疫苗具有很多优点,但DNA疫苗本身仍存在安全性问题:①转入体内的外源DNA可能整合到宿主染色体基因组DNA上,使宿主细胞转化为癌细胞；②少量抗原长期表达很可能引起针对该抗原的免疫耐受,在遭遇病原体后反而会引起严重感染。因此,尽快解决这些问题,使基因工程疫苗得到广泛的应用将是今后禽流感疫苗研究的重点。
7 结语
任何禽流感控制计划的最终目的是根除禽流感。采取以免疫接种和扑杀相结合的防控技术对策是我国的一大特色。其中，全面免疫是防控禽流感的关键技术措施和突出特点，具有至关重要的作用，在以后相当一段时间内仍需要坚持。随着我国养禽业的迅猛发展，对禽流感的防制越来越重要。因此，研制出安全、高效、生产工艺简单、价格低廉、适用的禽流感疫苗意义重大大，但是，禽流感病毒血清型众多、容易变异的特点给禽流感疫苗的研制带来了很大困难。随着科技的进步和人们对生命认识的不断加深，相信能够改变禽流感病毒防制状况的新型疫苗的出现指日可待。
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